1. 引言
多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons, pahs)是指由两个或两个以上苯环以线状、角状或簇状方式排列而成的一类持久性有机污染物，广泛存在于水体、土壤和沉积物中 。pahs主要来源于有机物的不完全燃烧，分为自然源和人为源。pahs普遍具有致畸、致癌、致突变作用(“三致效应”)，因其低水溶性、持久性、低生物可利用性，对生态系统和人类健康构成持久威胁 。pahs进入土壤后，极易被其中的有机质吸附后赋存于土壤中并逐渐累积，土壤已经成为pahs在环境中重要的“汇” 。早在1979年，美国环境保护署(united states environmental protection agency, usepa)就将16种pahs列为“优先控制污染物”。目前，pahs污染已经成为世界重大环境污染问题之一。
微生物修复技术具有成本低、效果好、二次污染少等特点，对pahs污染土壤修复前景广阔，是高效去除环境中pahs的主要手段之一 。因此，pahs高效降解菌株的筛选及修复效果的探究对实际环境中的pahs污染的微生物治理具有非常重要的指导意义。目前已知能够降解pahs的微生物包括芽孢杆菌属(bacillus) 、分枝杆菌属(mycobacterium) 、假单胞菌属(pseudomonas) 、红球菌属(rhodococcus) 、鞘氨醇单胞菌属(sphingomonas) 和黄杆菌属(flavobacterium) 等。但是，寡养单胞菌属细菌对于pahs的降解效果的研究鲜有报道。
本研究从石油污染土壤中分离筛选出一株多环芳烃降解菌，通过形态观察、生理生化特征及16s rrna序列比对，经鉴定为stenotrophomonas属细菌，命名为stenotrophomonas pavanii jex1 (以下简称jex1)。本研究以pahs的模式化合物菲(phenanthrene, phe)作为目标物质，探究菌株jex1的生长降解情况，确定菲降解的最优条件，以达到最佳降解效果。该菌属在pahs的好氧降解上鲜见报道，具有生物修复开发潜力，以期为受pahs污染土壤的微生物降解提供微生物资源。
2. 材料与方法
2.1. 材料和试剂
2.1.1. 实验试剂
菲(99%)购自阿拉丁(上海)，甲醇(色谱级)购自麦克林(上海)。
2.1.2. 培养基
lb培养基：蛋白胨10 g/l、酵母粉5 g/l、nacl 10 g/l。使用浓度为1 mol/l的naoh和hcl调节培养基ph值至7.0左右，固体培养基再添加15 g/l的琼脂。
无机盐培养基(msm)：mgso4·7h2o 0.2 g/l，cacl2 0.01 g/l，feso4·7h2o 0.001 g/l，kh2po4 1.5 g/l，na2hpo4·12h2o 1 g/l，mnso4 0.02 g/l，nh4cl 1 g/l。超纯水稀释至1000 ml，现配现用。使用浓度为1 mol/l的naoh和hcl调节培养基ph值至7.0左右。
菲降解培养基：取适量菲溶解于甲醇，配制成5.0 g/l的菲储备液；向灭菌后的25 ml无机盐培养基加入0.5 ml经0.22 μm无菌滤膜过滤除菌的菲储备液，使菲的工作浓度为100 mg/l。待甲醇挥发后获得降解培养基。
2.2. 降解菌的富集及筛选
取采样土壤10 g添加到已灭菌的100 ml msm培养基中，置于30℃摇床中，150 rpm震荡6~8 h后静置至土壤沉积在下层，吸取土壤上清液作为菌种液。取适量菲于250 ml无菌三角瓶中，待甲醇挥发完全后再加入90 ml无菌msm，最后按照10%的接种比加入10 ml土壤菌悬液，此时溶液中菲的浓度为100 mg/l，最后将三角瓶置于30℃摇床中150 rpm避光培养3 d，期间观察澄清透明的培养液是否变浑浊，取有菌株生长的培养液稀释涂布在lb固体培养基上30℃恒温培育24 h。将分离的细菌分别挑取单菌落接种于lb液体培养基中，振荡培养到对数生长期后接种至降解培养基中，筛选出能以菲作为碳源生长的细菌，连续传代驯化3次。采用分区划线法进一步纯化培养，即为本实验需要的菲降解菌株。降解菌株用lb液体培养基富集后，取生长对数期菌悬液与50%甘油等体积混合，置于无菌冻存管中，−80℃冷冻保种。
2.3. 菌体形貌观察
将培养至对数生长期的菌液离心去除上清液，菌体沉淀用适量无菌生理盐水清洗2~3次，用2.5% (v/v)的戊二醛溶液重悬菌体，在4℃条件下固定菌体16 h。固定后用无菌生理盐水清洗3次，然后用乙醇梯度脱水(乙醇浓度依次为：30%、50%、70%、90%、100%和100%的乙醇(v/v)各脱水15 min)。接着用叔丁醇洗涤菌体3次，每次10 min。菌体经真空冷冻干燥24 h后，用于扫描电镜(scanning electron microscope, sem)观察。
2.4. 降解菌的鉴定
参照《常见细菌系统鉴定手册》，对纯化后的菌株jex1进行革兰氏染色、乙酰甲基醇(voges-proskauer reaction, v.p.)、甲基红(methyl red, m.r.)、淀粉水解、硝酸盐还原、氧化酶、尿素水解、明胶液化和过氧化氢酶等生理生化特性试验。
将纯化后的菌株jex1进行16s rrna测序(上海派森诺生物科技股份有限公司)，使用通用的细菌扩增引物27f (agtttgatcmtggctcag)和1492r (ggttaccttgttacgactt)，pcr扩增步骤为95℃预变性5 min；95℃变性30 s、58℃退火30 s，72℃延伸90 s，计35次循环；最后72℃延伸7 min，4℃终止反应。再将pcr产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后进行测序，所获序列与美国国家生物信息中心(national center for biotechnology information, ncbi)中已知的序列用局部序列比对基本检索工具(basic local alignment search tool, blast)进行比对，并使用mega 11软件构建系统进化树。
2.5. 降解菌生长曲线
挑取固体培养基上的单菌落于lb液体培养基中振荡培养，待培养基变浑浊接种于新配制的培养基中，30℃、150 r/min恒温振荡培养，分别在培养后的第0、2、4、6、8、10、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48 h取样，持续培养48 h，测定菌液在600 nm波长下的吸光度，即od600，绘出菌株的生长量随时间的变化曲线。
2.6. 菌株jex1的降解特性
首先绘制标准曲线。配制浓度为0.5、1、5、10、20 mg/l的菲标准溶液，利用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, hplc)测定其峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。色谱柱规格：岛津c18 (250 mm × 4.6 mm)；色谱分析条件：采用紫外检测器，检测波长为254 nm，流动相为90%的甲醇和10%的水，流速为1 ml/min，进样量10 μl，柱温为30℃ 。
随后将纯化后pahs降解菌在lb液体培养基培养至对数生长期，离心去除培养基成分，用msm重悬并调整od600 = 1.000 ± 0.001，接入菲降解培养基中，振荡培养，每组设置3个平行。其中，空白组不添加降解菌，其他条件与实验组一致。分别考察初始菲浓度、温度、微生物接种比、ph值和转速对菲降解效果的影响。培养(2 d、4 d、6 d、9 d、12 d、15 d)结束后，8000 rpm，离心10 min除去生物质，用甲醇(1:1, v:v)稀释，稀释的上清液经0.22 μm有机滤膜过滤后用hplc检测其中残留的菲浓度，计算菲降解率，降解公式(1)如下：
(1)
其中，为对照组phe浓度，为实验组剩余phe浓度。
3. 结果与讨论
3.1. 降解菌的分离和鉴定
通过富集培养、涂布划线等操作，分离出一株多环芳烃降解菌，菌落形态和形状如所示。菌落形态呈圆形，表面光滑、边缘整齐、颜色为淡黄色()。扫描电镜图显示jex1菌落形状为杆状，大小为1.2~1.4 µm × 0.2~0.3 µm ()。随后对菌株进行生理生化鉴定，结果见。最后利用ncbi数据库对16s rrna进行同源性比对并构建系统进化树()，菌株jex1与寡养单胞菌(stenotrophomonas pavanii)具有高度同源性(相似度99%)，确定菌株jex1为寡养单胞菌属，命名为stenotrophomonas pavanii jex1。将菌株jex1的16s rrna基因序列上传至genbank数据库，获得登录号为pp412595。
figure 1. colony morphology (a) and sem images (b) of strain jex1
图1. 降解菌jex1的菌落形态(a)和sem图像(b)
table 1. biochemical and physiological characteristics of strain jex1
表1. 菌株的生理生化特征
试验项目 |
结果 |
试验项目 |
结果 |
革兰氏染色 |
− |
七叶灵(苷) |
|
尿素水解试验 |
|
过氧化氢酶试验 |
|
v.p.试验 |
− |
硝酸盐还原试验 |
|
m.r.试验 |
− |
吲哚试验 |
− |
淀粉水解试验 |
|
onpg (β-半乳糖苷酶) |
− |
枸橼酸盐(柠檬酸盐) |
|
硫化氢试验 |
− |
明胶液化 |
|
氧化酶试验 |
|
“−”表示阴性，“ ”表示阳性。
figure 2. phylogenetic tree of strain jex1
图2. 菌株的系统进化树
3.2. 菌株的生长曲线
为菌株jex1在lb液体培养基中的生长曲线。jex1在0~4 h为适应期，几乎不增殖；4 h后进入对数生长期，增殖迅速；继12 h之后生长速度明显变缓，逐渐进入稳定期。接种培养约12 h 的菌液进行降解实验，该时期菌株具备生长速率快和生物量大的双重优势，处于对数期和稳定期交汇点，利于实验开展。
figure 3. growth curve of jex1
图3. jex1的生长曲线
3.3. 菌株jex1的降解特性
3.3.1. 标准曲线绘制
采用hplc测定菲的含量，根据测定的峰面积值绘制标准曲线如下所示，线性相关性显著，相关系数均达0.999以上，说明各测试条件达到痕量分析要求。
figure 4. standard curve of quantitative analysis of pahs by hplc
图4. pahs高效液相色谱定量分析的标准曲线图
3.3.2. 降解菌对菲的降解性能测定
(1) 初始浓度
设置菲的初始浓度为50、100、200、500 mg/l，降解体系为25 ml，其中微生物接种比为10% (v:v)。最后放于运行条件恒为30℃，150 r/min的恒温振荡培养箱中遮光培养，考察jex1对不同初始浓度菲的降解效果，结果如所示。
研究结果表明，菌株jex1对50、100、200和500 mg/l菲的降解效率分别为79.23%、70.00%、47.51%和33.56%。当菲浓度过高时，菌株jex1对菲的降解速率明显下降，这可能是因为高浓度的菲对细胞的胁迫作用更强，毒害更大，致使菌体增殖慢，代谢活动明显减退。菲的初始浓度越小，细菌所受毒性迫害越小，降解效果就越好。总体上，菲的降解效率会随着初始浓度的增大而逐渐降低，其中50和100 mg/l菲的降解效率差距不大，后续实验在100 mg/l的浓度下进行。
figure 5. degradation-time curve of different initial concentrations of phe by strain jex1
图5. 菌株jex1对不同初始浓度菲的降解时间曲线
(2) 细菌接种比
将菌株jex1在降解体系中的接种比分别设置为1%、5%、10%、20% (v:v)，考察细菌接种比对菌株jex1降解菲(100 mg/l)的影响，结果如所示。
figure 6. effect of inoculation ratio on jex1 degradation efficiency
图6. 接种比对jex1降解效率的影响
当接种比由1%增加到10%时，菌株jex1对菲的降解能力随接种比的提高而增大，当接种比增加到 20%时，菌株jex1对菲的降解效率在从4 d后反而低于10%降解效率。接种比为1%、5%、10%、20%条件下，菌株jex1对菲的降解效率分别为30.87%、39.05%、70.00%和45.72%。随着接种比的增加，菌体生物量增大，生产更多数量的降解酶促进菲的去除。然而当体系中的接种比过高时，菌体之间会因竞争有限的营养物质、空间或氧气而对彼此产生抑制作用，同时也可能会减少菌体与菲的接触面积，不利于菲的降解。因此接种比过高并不利于菲的去除，甚至还可能降低对菲的降解率。在后续的实验中，株jex1的接种比均设为10%。
(3) 培养温度
不同环境温度(20、25、30、35、40℃)对菌株jex1降解菲(100 mg/l)的影响如所示。jex1降解的最佳温度为35℃，菲的降解效率为78.09%。在20℃、25℃和40℃条件下，菲的降解效率都大幅下降，表明温度过低或过高都会降低菌株jex1的降解能力。在适宜的温度下，菌体繁殖速度快，代谢活动旺盛，且能分泌更多的降解酶。同时酶的活性与温度有着十分密切的联系，最适温度条件下酶的活性相应增强，能更高效地去除菲。而过低或过高的环境温度，会抑制微生物的繁殖代谢，削弱生物酶的活性，从而降低菌株jex1对菲的降解效果。
figure 7. effect of temperature on jex1 degradation efficiency
图7. 温度对jex1降解效率的影响
(4) 初始ph值
微生物有其生长最适宜的ph值，在最适ph值条件下，菌体的代谢活动和生物酶活性才最高，才能实现微生物对污染物的高效降解。如所示，菌株jex1对ph的适应范围较广，当降解体系初始ph值在5~9范围内时，菌株jex1对100 mg/l菲的降解效率为34.77%~40.17%，降解效率随ph值的增加呈现先增加后降低的趋势，其中在ph值为7时，降解效率最高，表明菌株jex1的最适ph为中性。推测可能是较强的酸碱性会抑制微生物的生长和相应酶活性，导致代谢功能降低，主要表现为：ph值过高或过低会使细菌分泌的降解酶的数量减少或活性降低甚至失活，同时会使细胞膜的电位发生变化，影响菌株对营养物质的摄取，进而影响细菌的生长和代谢途径。
figure 8. effect of ph on jex1 degradation efficiency
图8. ph对jex1降解效率的影响
(5) 转速
由可知，转速条件为150 r/min时对菲的降解效果最好达78.9%，转速为120、140 r/min时对菲的降解效率降低。总体上，转速对细菌的影响较小。转速较低时，培养液内氧气量不足，降低了细菌与氧气的接触面积，从而导致微生物生长量较低，代谢活动迟缓，对菲的利用度降低。当转速达到180 r/min时，菲的降解效率反而有所降低，可能是转速过高导致细胞部分菌体死亡，从而抑制了菲的降解。
figure 9. effect of rotating speed on jex1 degradation efficiency
图9. 转速对jex1降解效率的影响
4. 结论
本研究从石油污染土壤中筛选获得1株能够高效降解菲的菌株，并测定该菌株对pahs菲的降解能力，得出以下结论：
(1) 通过形态观察、生理生化特征及16s rrna序列比对进行鉴定，该菌株属于寡养单胞菌属，命名为stenotrophomonas pavanii jex1。
(2) jex1有较强的环境适应能力，在温度(20℃~40℃)、ph (5~9)、菲初始浓度(50~500 mg l−1)条件下均能够降解菲。但当菲初始浓度100 mg l−1时，最佳降解条件为：35℃、10%细菌接种比、ph 7、150 r/min，15 d菲的降解效率可达78.09%。
综上，本研究为pahs的降解提供了新的菌株资源，对缓解土壤pahs污染具有重要意义。
基金项目
广西重点研发计划项目(桂科ab23075157)和广西自然科学基金(2023gxnsfaa026386)。
notes
*通讯作者。