基于网络药理学探讨大黄、决明子、枳实、三七联合给药治疗细菌性肠炎的靶向机制-凯发国际一触即发

1. 引言

细菌性肠炎是一种消化内科疾病，其主要是因沙门菌、粪肠球菌等细菌感染导致。细菌经口进入体内，在肠道感染引起肠炎，该病多见于小儿和住院患者，其临床可见高热、里急后重、剧烈腹痛和肉眼可见粪便带血或粘液；特别地，志贺菌属肠胃炎可能伴随抽搐。由于该病并发症包括脱水和电解质紊乱，故临床治疗应首先维持体液和电解质平衡。主要治疗手段为补液及对因治疗。目前临床一线治疗方案多采用广谱抗生素，但该药物亦会扰乱正常肠道菌群稳态，导致胃肠道更加脆弱，一定程度上影响了患者健康-。利用中药治疗细菌性肠炎，具有毒副作用较小、无耐药性等优点。因此，挖掘中药材对治疗细菌性肠炎具有重要作用。

大黄为蓼科植物唐古特大黄(rheum tanguticum)、掌叶大黄(rheum palmatum)的干燥根和根茎。大黄的化学成分主要有蒽醌类、蒽酮类、鞣质类、二苯乙烯类、黄酮类、多糖类等，临床实验表明，大黄具有抑菌、抗炎、抗氧化损伤及抗纤维化等作用。

决明子为豆科植物决明(senna tora)的干燥成熟种子，决明子的主要成分有蒽醌类、萘并、吡喃、酮类、多糖、纤维素等，具有抑菌、泻下和润肠通便的作用。

枳实为芸香科植物酸橙(citrus × aurantium)的干燥幼果。枳实的主要成分有黄酮类、生物碱类、挥发油类等，具有抗氧化、抗炎、抗菌、促进胃排空和小肠的推进及增加胃粘膜粘液腺体的作用。

三七为五加科人参属植物三七(panax notoginseng)的干燥根及根茎，三七中含有黄酮醇、三七多糖、氨基酸、挥发油类等化学成分，具有抗炎、抗氧化的作用。

目前，已有研究阐明大黄治疗细菌性肠炎的作用机制，但无大黄、决明子、枳实、三七联合用药方案的研究。本文采用网络药理学和分子对接技术，对大黄、决明子、枳实、三七四种传统中药材进行联合研究，探寻其治疗细菌性肠炎的作用机制。

2. 方法

2.1. 药物活性成分筛选

利用中药系统药理学分析平台(tcmsp)数据库(

)获得化合物的smiles信息，把smiles信息导入到swiss targetsprediction数据库()获取化合物靶点信息，按照条件probablilty > 0.2，筛选出符合要求的相关靶点。

2.3. 疾病靶点的获取

以“bacterial”和“enteritis”为关键词，在genecardsttd数据库()中搜索得到与细菌性肠炎相关的疾病靶点，进行整合去重。

2.4. 构建ppi网络

除将药物的相关靶点和疾病靶点导入venny 2.1.0 ()得到二者的交集靶点，并制作venny图。将交集靶点上传至string数据库(

)，选择为“official gene symbol”物种为“homo sapiens”。进行go富集分析和kegg通路分析。其中，go功能注释包括：参与的生物学过程(biological process, bp)、细胞组分(cellular component, cc)及分子功能(molecular function, mf)。在kegg数据库中除了对基因本身功能的注释，同时基因会参与人体的各个通路，得到的结果使用微生信网站()进行数据可视化分析。

2.7. 分子对接

将药物与疾病交集的靶点在cytoscape软件中以度值高低的标准筛选出top 2大黄、决明子、枳实、三七药物中的关键活性成分与ppi网络akt1、src这三个与疾病关系密切的靶点进行分子对接。在tcmsp数据库获取活性分子的“mol2”格式信息，通过profit数据库和rcsb pdb数据库收集靶点蛋白的三维结构，用pymol进行去水去配体处理，得到分子对接预处理的蛋白质文件，使用autodocktoos软件对蛋白加氢，识别蛋白位点，计算出对接口袋大小，进行分子对接，得到最小结合能，并利用pymol软件对分子对接结果进行可视化处理。

3. 结果

3.1. 大黄、决明子、枳实、三七的活性成分的获取与筛选

采用tcmsp数据库检索并筛选相关活性成分，控制条件为ob ≥ 30%，dl ≥ 0.18%，结果显示，大黄活性成分5个，决明子活性成分14个，枳实活性成分19个，三七活性成分4个，如所示。

table 1. active substance ingredient list

表1. 活性物质成分表

3.2. 大黄、决明子、枳实、三七的活性成分潜在靶点预测

将检索到的四种药物的活性成分在pubchem数据库中获取其对应的swiles结构，录入swiss taegetsprediction网站并设置种类为“homo sapiens”。结果筛选出大黄潜在靶点13个，决明子潜在靶点14个，枳实潜在靶点43个，三七潜在靶点113个，经删除重复项后，四种药物的潜在靶点共64个。

3.3. 疾病靶点数量

genecards和ttd中搜索bacterial enteritis，筛选并删除重复项后得到相关疾病靶点1802个。

3.4. ppi网络

将大黄、决明子、枳实、三七相关靶点导入venny 2.1.0作图，得交集靶点49个，如所示。将交集靶点上传至string数据中，筛选条件为“homo sapien”，其他参数为默认设置，导出tsv格式文件到cytoscape 3.10.0软件中分析，得到ppi网络图，如所示。使用cytonca插件对核心聚类蛋白进行分析，ppi网络图中degree值越大，颜色越深，节点越大，取degree值前十靶点分别是丝苏氨酸特异性蛋白激酶(akt1)、基质金属肽酶9 (mmp9)、人表皮生长因子受体(egfr)、前列腺素内过氧化物合成酶2 (ptgs2)、雌激素受体1 (esr1)、基质金属肽酶2 (mmp2)、非受体酪氨酸激酶(src)、激酶插入域受体(a型iii受体酪氨酸激酶，kdr)、间质–上皮细胞转化因子(met)和聚adp核糖基转移酶(parp1)。以betweenr closeness、degree、eigenvector、closeness值为筛选条件，得到核心靶点丝苏氨酸特异性蛋白激酶(akt1)、非受体酪氨酸激酶(src)，如所示。

figure 1. drug target-disease target venn chart

图1. 药物靶点–疾病靶点韦恩图

figure 2. ppi network diagram

图2. ppi网络图

table 2. top 10 target information table

表2. top 10靶点信息表

3.5. “中药–活性成分–疾病靶点”网络图

将大黄、决明子、枳实、三七的交集靶点与药物对应的成分导入cytoscape 3.10.0软件中。其中，菱形、平行四边形、六边形、三角形分别代表大黄活性成分、决明子活性成分、枳实活性成分、三七活性成分rhein (大黄酸)、eupatin (泽兰黄醇)、gallic acid-3-o-(6’-o-galloyl)-glucoside (没食子酸)、beta-sitosterol (β-谷甾醇)、emodin-1-o-beta-d-glucopyranoside (大黄素-1-o-β-d-吡喃葡萄糖苷)、stigmasterol (豆甾醇)、campest-5-en-3beta-ol、campest-5-en-4beta-ol、campest-5-en-5beta-ol、campest-5-en-6beta-ol、campest-5-en-7beta-ol、campest-5-en-8beta-ol、campest-5-en-9beta-ol、campest-5-en-10beta-ol、campest-5-en-11beta-ol、campest-5-en-12beta-ol、campest-5-en-13beta-ol、obtusin (1,7-二羟基-2,3,8-三甲氧基-6-甲基蒽-9,10-二酮)、obtusin (1,7-二羟基-2,3,8-三甲氧基-6-甲基蒽-9,10-二酮)、eriodyctiol (flavanone)、luteolin (木犀草素)、橙皮素(5,7-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)chroman-4-one,5,7-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)chroman-5-one5,7-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl),hroman-6-one,5,7-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)chroman-7-one7,5,7-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)chroman-8-one)、三甲氧基黄酮(5,7,4’-trimethylapigenin,5,7,5’-trimethylapigenin,5,7,6’-trimethylapigenin,5,7,7’-trimethylapigenin,5,7,8’-trimethylapigenin,5,7,9’-trimethylapigenin,5,7,10’-trimethylapigenin)、tetramethoxyluteolin (3,4,5,7-四甲氧基黄酮)、isosinensetin (3’,4’,5,7,8-五甲氧基黄酮)、sinensetin (5,6,7,3’,4’-五甲氧基黄酮)、nobiletin (川陈皮素)、dfv (戊酸双氟可龙)、quercetin (槲皮素)，得部分活性成分信息表如所示。

table 3. partial active substance ingredient table

表3. 部分活性物质成分表

3.6. 交集靶点go/kegg分析

3.6.1. 交集靶点的go功能富集分析

figure 3. enriched go term bp, cc, mf three in one bar chart

图3. 富集go term bp、cc、mf三合一柱状图

采用david数据库对大黄、决明子、枳实和三七的化学成分和细菌性肠炎相关的49个潜在靶点进行go分析。根据所富集的基因数对靶点进行排序，选取排名前10的条目进行可视化，绘制富集go term bp、cc、mf三合一柱状图。图中横坐标为go名称，纵坐标为富集的基因数(见)。结果得出大黄、决明子、枳实、三七的生物学过程主要涉及磷酸化(phosphorylation)、对淀粉样蛋白β的反应(response to amyloid-beta)、细胞外间质分解(extracellular matrix disassembly)、肽基酪氨酸磷酸化(peptidyl-tyrosine phosphorylation)、蛋白质磷酸化(protein phosphorylation)、细胞凋亡的负调节(negative regulation of apoptotic process)、蛋白质自体磷酸化(protein autophosphorylation)、蛋白质的正调节细胞核的定位(positive regulation of protein localization to nucleus)、胶原蛋白分解过程(collagen catabolic process)；分子组分包括细胞外液(extracellular space)、含蛋白复合物(protein-containing complex)、细胞外区(extracellular region)、受体复合物(receptor complex)、细胞表面(cell surface)、嗜天青颗粒管腔(azurophil granule lumen)、细胞膜筏(membrane raft)、细胞质核周区(perinuclear region of cytoplasm)、细胞质(cytoplasm)、细胞外间质(extracellular matrix)、atp结合(atp binding)、信号转导(signal transduction)；分子功能包括蛋白酪氨酸激酶活性(protein tyrosine kinase activity)、酶结合(enzyme binding)、内肽酶活性(endopeptidase activity)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)、丝氨酸型内肽酶活性(serine-type endopeptidase activity)、血红素结合(heme binding)、蛋白磷酸酶结合(protein phosphatase binding)、atp酶偶联跨膜转运蛋白活性(atpase-coupled transmembrane transporter activity)、细胞表面受体蛋白酪氨酸激酶活性(transmembrane receptor protein tyrosine kinase activity)。

3.6.2. 交集靶点的kegg通路的富集分析

通过kegg信号通路分析，筛选出富集得到的14条相关信号通路(p < 0.05)。对其进行可视化，绘制go、pathway富集结果气泡图(见)。图中横坐标表示通路的富集程度，数值越大，说明在研究数据中该通路越显著。纵坐标列出了与疾病相关的生物学通路。寻找气泡大且颜色深的通路，这表示在这些通路中不仅有较多的基因表现出显著的活动，而且统计显著性也高。结果表明，研究涉及癌症中的途径(pathways in cancer)、内分泌抵抗(endocrine resistance)、癌症中的蛋白聚糖(proteoglycans in cancer)、雌激素信号通路(estrogen signaling pathway)、前列腺癌(prostate cancer)、pi3k-akt信号通路(pi3k-akt signaling pathway)、vegf信号通路(vegf signaling pathway)、松弛素信号通路(relaxin signaling pathway)、egfr酪氨酸激酶抑制剂抵抗(egfr tyrosine kinase inhibitor resistance)流体剪切应力和动脉粥样硬化(fluid shear stress and atherosclerosis)、化学致癌作用–受体激活(chemical carcinogenesis-receptor activation)、小细胞肺癌(small cell lung cancer)、胃癌(gastric cancer)、化学致癌活性氧类(chemical carcinogenesis-reactive oxygen species)等途径。

figure 4. go, pathway enrichment result bubble chart

图4. go、pathway富集结果气泡图

3.7. 分子对接结果

以度值为筛选条件，利用autodock软件将所得大黄、决明子、枳实、三七top 3活性成分分别与网络中的akt1与src关键靶点进行9次分子对接。结合能均为负数(见)，表示上述药物活性成分与关键靶点能够不依赖外界就能自由结合。结合能数值越低，代表配体和受体的结合度越好，越容易发生作用。其中，src与luteotin和akt1与beta-sitosterol最低，分别为−8.4 kj/mol和−7 kj/mol。选取部分配体–受体的结合构象导入pymol软件，展示3d对接示意图及对接分子口袋图，其中3d对接示意图中，透明度较低的浅灰色结构为受体，深灰色部分为受体上所对接的分子团，如所示。

figure 5. 3d docking diagram and docking molecule pocket diagram

图5. 3d对接示意图及对接分子口袋图

table 4. table of molecular docking binding energy

表4. 分子对接结合能表

4. 讨论

细菌性肠炎是一种消化内科疾病，其具体表现为：细菌侵入肠道后，通过肠道黏膜上皮细胞间的间隙进入黏膜下层。细菌在黏膜下层引起炎症反应，使得小肠和大肠的黏膜上皮细胞发生变性、坏死和脱落，导致肠道出现炎症、水肿、充血等症状。治疗细菌性肠炎主要以抗生素为主，长期使用抗生素会产生耐药性且易引发真菌感染，利用中药治疗细菌性肠炎，具有降低耐药性和避免真菌感染现象等优势。研究表明 -，这四种药材在治疗肠炎中较为常用，故本文选取大黄、决明子、枳实、三七进行联合研究。

本研究通过构建ppi网络，发现大黄、决明子、枳实、三七治疗细菌性肠炎的核心靶点为丝苏氨酸特异性蛋白激酶(akt1)、非受体酪氨酸激酶(src)。有研究表明，akt1在细胞代谢、生长、迁移及基因表达等方面发挥重要作用，在急性炎症中起到关键作用。src信号通路可以促进巨噬细胞吞噬细菌，从而减轻细菌感染引起的组织损伤。通过构建“中药–活性成分–疾病靶点”网络图，筛选出大黄、决明子、枳实、三七治疗细菌性肠炎的重要活性物质：quercetin (槲皮素)、luteolin (木犀草素)、beta-sitosterol (β-谷甾醇)。有研究表明，槲皮素是一种黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌、抗病毒等药理作用，可以改善肠道感染，有效缓解肠炎性损伤。木犀草素大多以糖苷的形式广泛存在于多种中药材、天然药用植物及蔬菜中的一种黄酮类化合物，具有抗炎和抗菌、抗氧化、抗肿瘤、神经保护、抑制心血管疾病等多种药理作用。β-谷甾醇是一种植物甾醇，在结构上与胆固醇极为相似，且具有抗菌、抗炎、抗肿瘤等作用。

细菌性肠炎是由细菌感染导致引起肠炎，在感染时，包括革兰氏阴性细菌细胞壁物质lps在内的多种病原相关分子模式(pamps)，以及损伤细胞释放的损伤相关的分子模式(damps)均可以启动nf-κb转录因子途径，使得大量的致炎症细胞因子产生。nox家族的nlrp3亦可以监控到pamps和damps并激活通路，这导致了炎症反应被进一步激活。这种炎症的加剧会产生氧化应激，细胞进一步释放活性氧(ros)清除炎症诱导物，但ros这种下游因子又可以直接启动上游nf-κb转录因子路径，促使致炎症细胞因子表达过度活跃，使得氧化应激进一步激活炎症。在这种循环下，炎症将会反复发作，不断损伤肠道黏膜，黏膜长期处于修复状态并产生非典型增生，最终会导致癌变。故本文选用具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗癌特性的中药材来治疗细菌性肠炎。大黄、决明子、枳实、三七中的重要活性物质槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇等具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗癌作用。因此，本文选取大黄、决明子、枳实、三七四种中药材，通过其中重要的活性物质槲皮素、木犀草素、β-谷甾炎症醇等来达到治疗细菌性肠炎的目的。

kegg信号通路结果分析显示，大黄、决明子、枳实、三七作用于细菌性肠炎的靶点主要涉及癌症中的途径、内分泌抵抗、癌症中的蛋白聚糖、雌激素信号通路、前列腺癌、pi3k-akt信号通路、vegf信号通路、松弛素信号通路、egfr酪氨酸激酶抑制剂抵抗、流体剪切应力和动脉粥样硬化、化学致癌作用–受体激活、小细胞肺癌、胃癌、化学致癌活性氧类等途径。

槲皮素可通过影响traf6/tak1信号通路，抑制脂多糖诱导的bv-2细胞炎性损伤，抑制炎症相关蛋白的表达。此外，槲皮素抑制巨噬细胞中脂多糖(lps)诱导的肿瘤坏死因子α (tnf-α)的产生和lps诱导raw 264.7巨噬细胞产生炎症因子tnf-α、il-6和il-1β，它通过抑制src和syk介导的磷脂酰肌醇-3激酶(pi3k)-(p85)酪氨酸磷酸化和随后的toll样受体4 (tlr4)/myd88/pi3k复合物的形成来限制lps诱导的炎症，从而限制raw 264.7细胞中下游信号通路的激活。槲皮素通过nrf2信号通路减轻dmh诱导的dna氧化损伤，能够显著降低肿瘤干性相关蛋白的表达，抑制缺氧微环境中细胞的增殖，降低肿瘤细胞的干性。故槲皮素可以通过抑制炎症蛋白的表达，影响细胞增殖，减轻氧化损伤，降低肿瘤细胞干性等生理功能来治疗细菌性肠炎。

木犀草素对巨噬细胞炎性反应的抑制活性可通过抑制核转录因子κb (nuclearfactor κb, nf-κb)信号通路实现。不同水平抑制nf-κb信号通路下调炎症介质的产生。kelch样ech相关蛋白-1 (kelch-like ech-associated protein 1, keap1)/核因子e2相关性因子2 (nuclear factor erythroid 2 related factor 2, nrf2)信号通路是迄今发现最重要的黄酮类化合物抗氧化信号通路。木犀草素主要通过该信号通路降低细胞氧化应激水平发挥抗氧化活性。其通过促使keap1-nrf2解偶联，促进nrf2解离并发生核移位与抗氧化反应元件(antioxidant response element, are)结合，调控一系列抗氧化物质如谷胱甘肽血红素氧合酶(heme oxygenase-1, ho-1)、还原型辅酶ii醌氧化还原酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphat quinone oxidoreductase 1, nqo1)等的表达，进而发挥抗氧化作用。故木犀草素通过抑制炎症介质产生、降低细胞氧化应激水平等生理功能来治疗细菌性肠炎。

β-谷甾醇对巨噬细胞炎症因子(如il-8、tnf-α等)的产生有抑制作用。此外，β-谷甾醇溶液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌均有一定强度的抑制作用，抑菌率伴随浓度的提高而增加，这可能与β-谷甾醇通过增加抗菌肽的表达、与细菌结合位点结合等方式起到杀伤致病病原微生物的作用有关。且β-谷甾醇具有一定的羟自由基清除能力，如蒋琼凤等发现，从蓼蓝中提取的β-谷甾醇具有清除羟自由基和超氧阴离子的能力，β-谷甾醇有很好的去除超氧阴离子(o 2 − )的效果，其去除能力随着浓度的增加而增加。故β-谷甾醇有着良好的抗炎抗菌能力，对细菌性肠炎有着一定的治疗效果。

为了进一步探究各化合物与靶点的作用情况，将此3个药物活性成分分别与2个疾病靶点蛋白进行分子对接初步验证。结果显示，src与luteotin和akt1与beta-sitosterol的结合能较低，分子稳定性较高，结合能分别为−8.4 kj/mol和−7 kj/mol。分子对接结果显示，大黄、决明子、三七、枳实的关键活性成分与关键疾病靶点都有较好的亲和力，验证了通过网络药理学寻找药物作用机制、活性成分及靶点预测的可靠性。

综上所述，大黄、决明子、三七、枳实可依靠其内含有的槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇等有效活性物质具有的抗炎、抗菌、抗氧化、抗癌特性，作用于egfr酪氨酸激酶抑制剂抵抗通路、雌激素信号通路、前列腺癌、pi3k-akt信号通路、vegf信号通路等通路，通过多种信号传导途径治疗细菌性肠炎。本研究通过网络药理学验证了大黄、决明子、枳实、三七治疗细菌性肠炎的作用机制，为后续研发大黄、决明子、枳实、三七药物提供了理论基础。

notes

^*共同第一作者。

^#通讯作者。

参考文献