1. 引言
香烟烟雾(cigarette smoke, cs)中的有害物刺激物已成为当代公共卫生的一个重要议题，其对呼吸道产生的危害引起了广泛的关注[1]。这种烟雾中包含的多种有害物质，如尼古丁(nicotine)、一氧化碳(carbon monoxide)、焦油(tar)等，易于通过呼吸道进入人体，并导致不同程度的健康问题，尤其对那些已经具有过敏体质的人更为严重[2] [3]。长期刺激下可加剧过敏反应并伴随肺部发炎，包括气喘(asthma)、慢性支气管炎(chronic bronchitis)，甚至是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease) [4] [5]。
过敏性炎症(allergic inflammation)是一种免疫系统的异常反应，当接受外来刺激物如前述香烟烟雾等时，因第一型辅助型t细胞(th1)与第二型辅助型t细胞(th2)分泌的细胞因子(cytokines)失衡，影响身体免疫细胞对于讯息产生过度反应[6]。这些过量的细胞因子，也是炎症因子，会造成身体慢性的发炎反应，长久负面影响身体多处器官、循环系统等[7]。有关如何有效降低香烟烟雾诱发的过敏性炎症反应的研究仍相对有限。因此本试验以香烟烟雾为影响因子，加剧过敏体质者之过敏性炎症症状，并了解免疫系统对烟雾中有害物质的反应，以及介入性方法(如本研究中使用的鼠李糖乳杆菌gklc1)对于缓解炎症反应的影响，有助于深入了解过敏性炎症的机制和发展相应的治疗策略。
2. 材料与方法
2.1. 菌株来源与制备
鼠李糖乳杆菌gklc1 (lactobacillus rhamnosus gklc1)自台湾妇女所捐赠的母乳检体中分离而得，经16s rrna鉴定，并寄存于中国普通微生物菌种保藏管理中心(china general microbiological culture collection center, cgmcc)，寄存编号cgmcc 15202。实验菌株gklc1培养于1 l之mrs (bd difco, usa)培养基中，经37℃，16小时培养后，以5000 rpm (eppendorf centrifuge 5804r, germany)，室温离心10分钟取得菌泥，混入20%脱脂奶粉后冷冻干燥获得活菌菌粉，保存于−20℃备用。
2.2. 试验动物与分组
5周龄雄性balb/c小鼠购自台湾国家动物中心(national laboratory animal center, taiwan)。动物饲养于中国医药大学动物中心之独立通气饲育盒(individual ventilated cage)中，室温22℃ ± 2℃，湿度40%~60%，定时12小时光照与黑暗，饲料及无菌逆渗透水均任由小鼠自由取食。小鼠饲养2周适应环境后，进行随机分组，分为过敏对照组(ova cs)与益生菌gklc1组(gklc1)，每组6只。
2.3. 试验设计
试验小鼠皆于试验第0天及第12天以腹腔注射(intraperitoneal injection)卵白蛋白抗原(ovalbumin, ova)进行全身性致敏，并于试验第17天至第23天以喷雾吸入(inhalation) 2% ova过敏原的方式进行局部性致敏。试验第24天起，每日使小鼠暴露于香烟烟雾(cigarette smoke, cs)下10分钟，连续30天，加重小鼠过敏性炎症反应(图1)。制备注射用之ova为先将500 μg/ml ova与不完全佐剂(incomplete freund’s adjuvant)以1:1混合均匀后，经无菌过滤膜除菌后立即使用。
试验第24天至第54天，益生菌gklc1组之小鼠每日管喂4.5 mg活菌gklc1菌粉，相当60 kg成人每日摄取约1 g；对照组之小鼠则以管喂等量之生理食盐水作为对照。试验结束后，所有小鼠皆进行牺牲采血，并收集肝脏小叶。
figure 1. animal model of allergic inflammation induced by ovalbumin antigen (ova) and cigarette smoke (cs) in mice
图1. 卵白蛋白抗原(ova)及香烟烟雾(cs)诱导小鼠过敏性炎症之动物模型
2.4. 血液内毒素分析
以市售内毒素检测试剂(genescript, piscataway, new jersey, usa)，利用lal (limulus amebocyte lysate)呈色检验法，分析血液中内毒素含量。取0.1 ml血清加入0.1 ml鲎试剂(lal)，于37℃下反应45分钟后，以分光亮度计检测波长545 nm下之吸亮度。内毒素浓度以大肠杆菌(escherichia coli)来源的内毒素为标准品对照。
2.5. 肝脏组织之细胞激素及肝脏酵素活性分析
取小鼠肝脏0.3 g以hepes buffer均质后，以3000 ×g、4℃下离心10分钟，取上清液以市售生化分析套组及elisa方法，依据厂商操作说明，分析干扰素-γ (interferon-γ, ifn-γ)、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, tnf-α)、白介素-4 (interleukin-4, il-4)、白介素-5 (interleukin-5, il-5)含量，以及天门冬胺酸胺基转移酶(aspartate transaminase, ast)、麸丙转胺酶(alanine aminotransferase, alt)活性。上述细胞激素elisa kit购自ebioscience (san diego, ca, usa)。
2.6. 生物统计分析
实验结果以平均值 ± 标准偏差(mean ± sd)表示，以student’s t test进行统计分析，比较对照组与益生菌gklc1组之组间差异，显著性差异之判断标准为p < 0.05。
3. 结果
3.1. 小鼠体重变化
试验期间，各组小鼠之体重变化如表1所示。两组体重并无显著差异，亦无观察到个体的不良反应，说明益生菌gklc1对于受试动物无负面影响。
table 1. change of body weight (g)
表1. 体重变化(公克)
试验天数 |
第0天 |
第14天 |
第28天 |
第42天 |
第56天 |
过敏对照组(ova cs) |
26.4 ± 1.7 |
28.2 ± 2.2 |
28.2 ± 1.5 |
29.2 ± 1.7 |
30.2 ± 1.4 |
gklc1组 |
27.1 ± 0.7 |
29.3 ± 0.6 |
29.8 ± 0.8 |
30.2 ± 0.7 |
30.7 ± 1.1 |
p value |
0.4283 |
0.3307 |
0.0646 |
0.2538 |
0.5663 |
3.2. 血液内毒素含量
益生菌gklc1组的小鼠血清中内毒素含量显著低于过敏对照组(p < 0.001)，说明在相同的过敏刺激物环境下，益生菌gklc1的补充有助于增进身体之抵抗的能力，减少内毒素通过血管、扩散至全身引起相关炎症的机率(图2)。
3.3. 肝脏组织之细胞激素
分析小鼠肝脏中与th1细胞分泌相关的细胞激素，益生菌gklc1组之ifn-γ (图3(a))及tnf-α (图3(b))含量皆显著低于过敏对照组(p < 0.01)，说明益生菌gklc1的摄入可降低肝脏中th1细胞的活性。另外，与th2细胞分泌相关的细胞激素il-4 (图4(a))、il-5 (图4(b))，亦以益生菌gklc1组显著低于过敏对照组(p < 0.001, p < 0.01)，意即显示菌株gklc1具抑制过敏环境下引起之th2细胞的潜力。
3.4. 肝脏酵素活性差异
肝指针ast及alt表示肝功能外，亦显示肝发炎的程度。益生菌gklc1组之小鼠肝指标皆显著低于过敏对照组(图5)，说明菌株gklc1补充有助于降低过敏引起之发炎反应。
数值均以mean ± sd (n = 6)表示，星号表示统计上显著差异(***p < 0.001)。
figure 2. level of serum endotoxin
图2. 血清中内毒素含量
数值均以mean ± sd (n = 6)表示，星号表示统计上显著差异(**p < 0.01)。
figure 3. the level of ifn-γ (a) and tnf-α (b) in liver
图3. 肝脏中ifn-γ (a)及tnf-α (b)之浓度
数值均以mean ± sd (n = 6)表示，星号表示统计上显著差异(**p < 0.01, ***p < 0.001)。
figure 4. the level of il-4 (a) and il-5 (b) in liver
图4. 肝脏中il-4 (a)及il-5 (b)之浓度
4. 讨论
srutkova等人的研究指出，鼠李糖乳杆菌分泌的胞外多糖可帮助调节th2细胞激素反应并改善ova致敏小鼠的过敏性发炎症状[8]。这一结果显示，益生菌可以通过调节免疫系统来减轻过敏反应。同样，
数值均以mean ± sd (n = 6)表示，星号表示统计上显著差异(*p < 0.05, **p < 0.01)。
figure 5. the active concentration of ast (a) and alt (b) in liver
图5. 肝脏酵素ast (a)及alt (b)活性浓度
hou等人亦通过细胞实验及ova致敏小鼠动物实验模式证实，鼠李糖乳杆菌可通过下调stat6/spdef通路来改善黏液分泌并缓解呼吸道发炎症状[9]，显示益生菌的补充可作为过敏性发炎反应的有效治疗方法。本研究实证，利用ova及香烟烟雾可诱导小鼠产生严重的过敏性炎症，影响呼吸道屏障，导致循环系统中的内毒素增高(图2)、并引起相关脏器中的发炎反应(图3、图4)。且鼠李糖乳杆菌gklc1的介入可有效降低上述炎症反应，达到减敏、抗发炎的调节效果。这与srutkova和hou的研究一致，进一步支持了益生菌在减轻过敏性炎症中的重要作用。
在肝脏酵素活性的分析指标中，以ast为大量存在于肝脏细胞中的酵素，当细胞发炎或坏死时，ast会自细胞中被释放至血液，临床上因此可应用于肝脏功能的诊断[10]。本次试验中，补充菌株gklc1皆可有效降低肝脏中因过敏炎症引起的高浓度ast或alt的现象(图5)。参考过去菌株gklc1的功效性研究，该菌株在酒精性脂肪肝的动物模式下，有肝脏保护的功效，与本次试验结果中的护肝指标结果符合[11]，显示出菌株gklc1在多种炎症情况下的脏器保护作用。更进一步地推论，在过敏体质下，菌株gklc1可透过降低过敏引起的炎症因子达到减缓过敏症状、减少内毒素进入循环系统，降低对于肝脏等器官的伤害[12] [13]。
本研究以鼠李糖乳杆菌gklc1介入应用于减缓烟雾所加剧的过敏性炎症反应。结果显示，益生菌的补充，特别是鼠李糖乳杆菌gklc1，具有潜在的临床应用价值，尤其在治疗过敏性炎症反应和保护肝脏功能方面。这为未来的临床研究提供了有力的理论支持和研究基础。
notes
*通讯作者。