1. 引言
玫瑰茄(hibiscus sabdariffa linn.)是锦葵科木槿属一年生草本植物，其花萼具有轻微香气，呈现的红紫色来自天然色素花青素[1]。玫瑰茄花青素属于多酚类物质，是一种良好的氧游离基清除剂和脂质过氧化抑制剂，可有效清除超氧阴离子自由基和羟基自由基，也参与磷脂、花生四烯酸的新陈代谢和蛋白质磷酸化，保护脂质不发生过氧化损伤，是目前世界上发现的清除自由基最有效的物质之一[2]。
花青素的提取工艺最常规的方法是固–液萃取，有超声辅助提取法[3]和溶剂提取法[4]，水、乙醇和丙酮均可作为萃取剂。为了提高花青素的稳定性，提取过程中往往会加入少量酸，但酸会使酰基化的花青素部分水解。为提高花青素溶出率，常采用加热的方法，但温度升高会使花青素降解，对其生理活性功能造成不利影响[5]。因而，寻求更加高效、先进的工艺技术，得到更好的提取、分离效果，使玫瑰茄得到更全面的开发，值得探索。酶法提取是一种天然色素提取的有效方法[6]，微波辅助提取(microwave-assisted extraction, mae)也被广泛应用于有机酚和天然产物的提取[7]。然而，采用酶法耦合超声波法从玫瑰茄花萼中提取花青素还未见报道。
随着科学技术的发展，合成色素逐步被天然色素取代已是大势所趋，开发安全可靠的天然色素对保障人民身体健康具有十分重要的意义。本研究以玫瑰茄干花萼为试验材料，采用纤维素酶耦合超声波法优化花青素提取工艺，并探究实际提取效果。旨在促进玫瑰茄资源的高值化综合利用，为天然色素的开发提供技术支撑。
2. 材料与方法
2.1. 材料与试剂
玫瑰茄干花萼，选用高原自然晒干熟透紫红黑亮饱满花萼，购自云南省武定县。纤维素酶，购自北京鸿润宝顺科技有限公司，酶活力为2000 u/g。盐酸、乙醇溶剂，购自国药集团化学试剂有限公司。本实验所用试剂均为分析纯。
2.2. 主要仪器与设备
本研究主要试验仪器与设备见下表1。
table 1. main experimental instruments and equipment
表1. 主要试验仪器与设备
仪器名称 |
型号 |
生产厂家 |
电子天平 |
fa1004 |
上海舜宇恒平科学仪器有限公司 |
电热鼓风干燥箱 |
gzx-9240mbe |
上海博讯实业有限公司医疗设备厂 |
手提式小型高速粉碎机 |
dft-50a |
上海左乐仪器有限公司 |
ph计 |
phs-3e型 |
上海仪电科学仪器股份有限公司 |
超声波清洗机 |
sb-5200dtd |
宁波新芝生物科技股份有限公司 |
离心机 |
eppendorf 5810r |
尹若达仪器有限公司 |
紫外可见分光光度计 |
uv-5200型 |
上海元析仪器有限公司 |
2.3. 方法
2.3.1. 玫瑰茄干花萼的预处理
将适量的玫瑰茄干花萼平铺在干净的玻璃板上，(45 ± 1)℃下烘干至恒重(冷却10 min前后质量之差不大于2 mg)。取适量干燥后的花萼放入高速多功能粉碎机中打磨成粉，过80目筛密封避光保存备用。
2.3.2. 纤维素酶耦合超声波提取玫瑰茄花青素
称取1.0 g样品于50 ml离心管中，加入适量纤维素酶，按不同的料液比倒入配制好的提取剂(10% hcl (0.1 mol/l) 90%乙醇(75%))。把离心管放入超声波清洗机中，设定超声时间为20 min、超声功率为200 w、超声温度为30℃。同时，为了避免样品在超声过程中温度升高，在超声波清洗机里适时加冷水，保持温度恒定。超声后在4℃下，4000 r/min离心10 min，上清液即为花青素提取液。
2.3.3. 单因素试验
单因素试验因素、水平设置如下：纤维素酶浓度：0、0.2、0.4、0.6、0.8 u/ml；液料比：10:1、20:1、30:1、40:1、50:1 ml/g；超声温度：30、35、40、45、50℃；超声时间：5、10、15、20、25 min；超声功率：140、160、180、200、220 w。每个试验做三次平行，取平均值。
2.3.4. 响应面试验优化玫瑰茄花青素提取工艺
table 2. factors and levels used in response surface experimental design
表2. 响应面试验设计因素与水平
水平 |
因素 |
a液料比(ml/g) |
b超声温度(℃) |
c超声/酶解时间(min) |
d超声功率(w) |
−1 |
10 |
30 |
15 |
140 |
0 |
20 |
35 |
20 |
160 |
1 |
30 |
40 |
25 |
180 |
采用响应面中心组合试验设计(box-behnken)，设计自变量为液料比、超声温度、超声时间和超声功率的四因素三水平试验(表2)，以提取得率为响应值，确定各因素的最佳水平值。
2.3.5. 玫瑰茄花青素提取得率的测定
采用ph示差法测定提取花青素的提取得率[8]。ph1.0与ph4.5缓冲液配制参照江岩的方法[9]。花青素在溶液介质中存在4种结构形式，在某一ph值下处于动态平衡[10]。ph值改变时动态平衡被打破，因此花青素溶液用缓冲液稀释后，必须静置一段时间，建立新的动态平衡后，才能测定其吸光度。本试验静置时间为2 h。
计算公式如下：
花青素得率(mg/g)
式中：△a = (a520nm, ph1.0 − a700nm, ph1.0) − (a520nm, ph4.5 − a700nm, ph4.5)；v为待测花青素样品提取液总体积，ml；n为测定时提取液稀释倍数；
为矢车菊色素-3-葡萄糖苷的消光系数，26,900；mw为矢车菊色素-3-葡萄糖苷的相对分子质量，449.2；m为玫瑰茄干花萼粉末样品质量，g；l为比色光程长度，l cm。
以蒸馏水为对照，用a700nm来消除样液浑浊的影响。
2.4. 数据处理
所有试验指标的测定均重复三次，结果取平均值并计算标准误差。数据采用excel、origin 2019b与design expert 12.0软件进行分析和绘制。用spss 17.0进行anova单因素方差分析并检验数据的差异显著性。
3. 结果与分析
3.1. 玫瑰茄花青素最大吸收波长的测定
吸取一定体积的玫瑰茄花青素提取液稀释后，将蒸馏水作为对照，波谱扫描400~600 nm的吸光度，由图1可知，提取液的特征吸收峰在520 nm左右处出现，这与师文添[11]、陆国权等[12]的研究结果一致，说明该提取液中的色素有花青素特征，为花青素类物质。
figure 1. uv-visible spectrum scanning diagram of roselle anthocyanins
图1. 玫瑰茄花青素紫外可见波谱扫描图
3.2. 单因素试验结果
3.2.1. 纤维素酶浓度对玫瑰茄花青素提取得率的影响
纤维素酶浓度对玫瑰茄花青素得率的影响如图2所示。添加纤维素酶处理的花青素提取得率显著高于未添加对照处理(p < 0.05)，最高达到9.58 mg/g，比对照提高了13.91%。随着纤维素酶浓度的升高，玫瑰茄花萼花青素提取得率不断提高，这可能是因为随着酶添加量的增大，增强了对花萼细胞壁的水解作用，底物与酶的接触更加充分，有利于花青素的释放，提高了提取得率，这与张辉青花等的研究一致[6]。当纤维素酶浓度达到0.4 u/ml后提取得率增加差异不显著(p > 0.05)，这可能是因为底物的量有限，此时反应已经达到饱和[13]。因此，从节约成本、提高生产经济效益考虑，选择纤维素酶浓度为0.4 u/ml。
figure 2. effect of cellulase concentration on the extraction efficiency of roselle anthocyanins
图2. 纤维素酶浓度对玫瑰茄花青素得率的影响
3.2.2. 液料比对玫瑰茄花青素提取得率的影响
figure 3. effect of liquid-solid ratio on the extraction efficiency of roselle anthocyanins
图3. 液料比对玫瑰茄花青素得率的影响
液料比对花青素得率的影响如图3所示。在10:1~40:1之间时，花青素得率与液料比呈正相关性，在40:1时达到最大值，为9.62 mg/g。但方差分析结果表明，在20:1~40:1之间时，提取得率并无显著性增加(p > 0.05)。这可能是提取液体积较小时，整个提取反应体系较小，溶质浓度过高，流动性差，致使底物与酶的接触不充分、不彻底，提取得率较低。当提取液体积增加时，整个提取反应体系流动性增强，反应更为彻底，提取得率随之升高。但当提取液体积为样品质量数值的50倍时，提取得率反而降低，可能是因为反应体系过大，纤维素酶和底物的浓度降低，酶解效果并不理想，因此影响了提取得率[14]。考虑到便于后期的纯化和浓缩，选择液料比为20 ml/g。
3.2.3. 超声温度(酶解温度)对玫瑰茄花青素提取得率的影响
超声温度(酶解温度)对玫瑰茄花青素提取得率的影响如图4所示。在30℃~50℃范围内，玫瑰茄花萼花青素提取得率随着温度的升高显著地呈现先升高后降低的趋势，在35℃达到最大值，为9.41 mg/g。可能是因为随着温度的升高，纤维素酶活性增强，酶促反应加剧，有利于花青素的提取。但超声温度(酶解温度)持续升高，提取得率会有所下降，可能有两方面的原因：一方面，因温度过高，纤维素酶活性可能降低或失活，酶解速率下降，导致花青素提取得率下降；另一方面，超声温度过高，可能会引起部分花青素的分解。因此，选择超声温度(酶解温度)为35℃。
figure 4. effect of ultrasonic temperature (enzymatic hydrolysis temperature) on the extraction efficiency of roselle anthocyanins
图4. 超声温度(酶解温度)对玫瑰茄花青素得率的影响
3.2.4. 超声时间(酶解时间)对玫瑰茄花青素提取得率的影响
figure 5. effect of ultrasonic time (enzymatic hydrolysis time) on the extraction efficiency of roselle anthocyanins
图5. 超声时间(酶解时间)对玫瑰茄花青素得率的影响
采用纤维素酶耦合超声波提取，超声时间与酶解时间相同，超声时间(酶解时间)对玫瑰茄花青素提取得率的影响如图5所示。在超声时间(酶解时间)为5~20 min时，随着反应时间的增加，花青素提取得率逐渐显著性升高(p < 0.05)，超声时间(酶解时间)在20 min时，提取得率达到最高，为9.92 mg/g。这可能是刚开始反应时，由于时间短，纤维素酶与超声波耦合作用还未充分发挥，花青素未能释放完全。当反应时间相应有所延长后，耦合作用效果进一步增强，反应更加完全彻底，因此提取得率显著性提高(p < 0.05)。但20 min后，如果继续超声(酶解)，花青素得率反而下降。很有可能是因为在反应已经达到饱和之后，继续超声，导致花青素的结构被影响了，或者是发生了降解，导致提取效果不佳。因此，选择超声时间(酶解时间)为20 min。
3.2.5. 超声功率对玫瑰茄花青素提取得率的影响
适当的超声处理有利于细胞内物质的浸出[15] [16]。超声功率对玫瑰茄花青素提取得率的影响如图6所示。玫瑰茄花萼花青素提取得率随着超声功率的升高，走向为先升高后降低，在160 w时达到最大值，为9.61 mg/g。这可能是因为超声可以增强细胞的空化作用并通过机械振动使分子运动加剧，细胞壁破碎程度加大，促进花青素溶出，同时由于颗粒尺寸减小和催化体系表面积增加，也可提高花青素的提取得率。当超声功率过小时，细胞壁的破碎程度较小，提取得率不高。当超声功率过大时，超强声作用导致花青素构象发生改变甚至破坏，从而降低了提取得率。因此，选择超声功率为160 w。
figure 6. effect of ultrasonic power on the extraction efficiency of roselle anthocyanins
图6. 超声功率对玫瑰茄花青素得率的影响
3.3. 响应面优化试验结果
3.3.1. box-behnken试验设计及结果
利用design expert软件对试验数据进行多元回归拟合，得到液料比(a)、超声温度/酶解温度(b)、超声时间/酶解时间(c)、超声功率(d)的多元回归模型为：y = 11.38 0.4883a 0.0508b 0.1175c 0.045d 0.0475ab − 0.0675ac − 0.08ad 0.0625bc 0.0175bd − 0.0175cd − 0.3411a2 − 0.4598b2 − 0.5848c2 − 0.3461d2。响应值结果见表3，方差分析结果见表4。
table 3. response surface experimental design scheme and response value results
表3. 响应面试验设计方案及响应值结果
试验号 |
a液料比 |
b超声温度/酶解温度 |
c超声时间/酶解时间 |
d超声功率 |
y花青素提取得率 |
1 |
−1 |
0 |
−1 |
0 |
9.83 |
续表
2 |
1 |
−1 |
0 |
0 |
11.01 |
3 |
1 |
0 |
1 |
0 |
11.04 |
4 |
0 |
0 |
1 |
1 |
10.62 |
5 |
−1 |
0 |
0 |
1 |
10.28 |
6 |
0 |
0 |
0 |
0 |
11.33 |
7 |
−1 |
−1 |
0 |
0 |
10.07 |
8 |
0 |
0 |
0 |
0 |
11.37 |
9 |
1 |
1 |
0 |
0 |
11.22 |
10 |
0 |
1 |
0 |
1 |
10.71 |
11 |
−1 |
0 |
0 |
−1 |
9.99 |
12 |
0 |
0 |
−1 |
1 |
10.45 |
13 |
0 |
0 |
0 |
0 |
11.39 |
14 |
0 |
−1 |
1 |
0 |
10.28 |
15 |
−1 |
1 |
0 |
0 |
10.09 |
16 |
0 |
1 |
0 |
−1 |
10.67 |
17 |
1 |
0 |
0 |
1 |
11.09 |
18 |
0 |
0 |
1 |
−1 |
10.52 |
19 |
0 |
−1 |
0 |
−1 |
10.57 |
20 |
0 |
−1 |
0 |
1 |
10.54 |
21 |
0 |
0 |
0 |
0 |
11.45 |
22 |
1 |
0 |
0 |
−1 |
11.12 |
23 |
0 |
0 |
−1 |
−1 |
10.28 |
24 |
0 |
1 |
−1 |
0 |
10.12 |
25 |
0 |
−1 |
−1 |
0 |
10.19 |
26 |
0 |
0 |
0 |
0 |
11.35 |
27 |
0 |
1 |
1 |
0 |
10.46 |
28 |
−1 |
0 |
1 |
0 |
10.25 |
29 |
1 |
0 |
−1 |
0 |
10.89 |
由表4可知，玫瑰茄花青素提取得率的整体模型方程的f值为68.11，具有极显著性(p < 0.01)，表明回归方程的因变量与自变量之间存在明显的线性关系，该试验方法可靠。失拟项f值为4.15，不具有显著性(p > 0.05)，同样证明了选择这个模型是比较合适的。方程的相关系数r2为0.9855，表示这个模型与试验的拟合程度较高。方程的校正决定系数r2adj为0.9711，预测r2pre为0.922，两者之差为0.0491，小于0.2，表明该模型准确解释数据的能力良好。因此，该模型方程可以用来分析与预测不同提取条件下玫瑰茄花青素得率的工艺条件。由f值分析结果判断各因素对玫瑰茄花青素得率的影响力为：a (液料比) > c (超声时间/酶解时间) > b (超声温度/酶解温度) > d (超声功率)。
table 4. analysis of variance of response surface experimental regression model
表4. 响应面试验回归模型方差分析
方差来源 |
平方和 |
自由度 |
均方 |
f值 |
p值 |
模型 |
6.57 |
14 |
0.4696 |
68.11 |
<0.0001 |
a液料比 |
2.86 |
1 |
2.86 |
415.07 |
<0.0001 |
b超声温度/酶解温度 |
0.0310 |
1 |
0.0310 |
4.50 |
0.0523 |
c超声时间/酶解时间 |
0.1657 |
1 |
0.1657 |
24.03 |
0.0002 |
d超声功率 |
0.0243 |
1 |
0.0243 |
3.52 |
0.0815 |
ab |
0.0090 |
1 |
0.0090 |
1.31 |
0.2718 |
ac |
0.0182 |
1 |
0.0182 |
2.64 |
0.1263 |
ad |
0.0256 |
1 |
0.0256 |
3.71 |
0.0745 |
bc |
0.0156 |
1 |
0.0156 |
2.27 |
0.1544 |
bd |
0.0012 |
1 |
0.0012 |
0.1777 |
0.6798 |
cd |
0.0012 |
1 |
0.0012 |
0.1777 |
0.6798 |
a² |
0.7546 |
1 |
0.7546 |
109.45 |
<0.0001 |
b² |
1.37 |
1 |
1.37 |
198.94 |
<0.0001 |
c² |
2.22 |
1 |
2.22 |
321.79 |
<0.0001 |
d² |
0.7769 |
1 |
0.7769 |
112.69 |
<0.0001 |
残差 |
0.0965 |
14 |
0.0069 |
|
|
失拟值 |
0.0880 |
10 |
0.0088 |
4.15 |
0.0912 |
纯误差 |
0.0085 |
4 |
0.0021 |
|
|
总离差 |
6.67 |
28 |
|
|
|
注：p < 0.05，差异显著；p < 0.01，差异极显著。
3.3.2. 响应面分析与最优条件的确定
利用design expert软件对试验数据进行分析，通过对6组响应面及等高线图(图7)的形状分析4个因素间的交互作用。
figure 7. response surface and contour diagram
图7. 响应面及等高线图
进一步对拟合的回归方程进行分析可得，最优条件为：液料比27.19:1 ml/g，超声温度35℃，超声时间20.32 min，超声功率159.64 w，玫瑰茄花青素得率最高为11.56 mg/g。为了方便实际试验操作，将条件调整为：液料比27:1 ml/g，超声温度35℃，超声时间20 min，超声功率160 w。根据调整后的条件，花青素得率高达11.38 mg/g，把这个数据与模型预测值的11.56 mg/g相比，只有1.58%的相对误差。证明在此模型下得到的最优条件可靠性较高，可以作为纤维素酶耦合超声波提取玫瑰茄花青素工艺的回归分析和参数优化。
4. 结论与讨论
本研究以玫瑰茄干花萼为试验材料，采用纤维素酶耦合超声波法优化花青素提取工艺，在单因素试验的基础上，选用响应面中心组合试验，建立起一个以液料比、超声温度、超声时间和超声功率为自变量，玫瑰茄花青素提取得率为因变量的多元回归模型，研究确定各因素的最佳水平值，并探究实际提取效果，旨在为天然色素玫瑰茄花青素的开发提供技术支撑。
研究结果表明，纤维素酶耦合超声波法工艺提取玫瑰茄花青素的最高效、节能的条件为：纤维素酶浓度0.4 u/ml，液料比27:1 ml/g，超声温度35℃，超声时间20 min。此时，花青素得率为11.38 mg/g，与模型预测值相比，相对误差为1.58%。采用本法提取的玫瑰茄花青素得率比黄晓德等[4]、曾哲灵等[8]的溶剂提取法高，也比杨大兵等[17]采用超声波提取的得率高。但本研究未选用其他酶作为纤维素酶的对照，比如果胶酶或者复合酶，还有待进一步探索。
基金项目
金华市一般科技计划项目“金华火腿传统印泥配方工艺技术改进”(2021-4-363)。
notes
*第一作者。
#通讯作者。